线粒体

一、线粒体的形态、数量和结构

（一）线粒体的形态、数量与细胞的类型和生理状态有关

  1. 在低渗环境下，线粒体膨胀张如泡状；在高渗环境下，线粒体又伸长为线状。
  2. 线粒体的形态也随细胞发育阶段不同而异，如人胚肝细胞的线粒体，在发育早期为短棒状，在发育晚期为长棒状。
  3. 酸性时线粒体膨胀，碱性时线粒体为粒状。
  4. 线粒体的数量可因细胞种类而不同，最少的细胞只含1个线粒体，最多的达50万个。这与细胞本身的代谢活动有关，代谢旺盛时，线粒体数量较多，反之线粒体的数量则较少。

（二）线粒体的结构

两层单位膜将线粒体内部空间与细胞质隔离，并使线粒体内部空间分隔成两个膜性空间，组成线粒体结构的基本支架（图6-1）。
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1.外膜

外膜(outer membrane)是线粒体外层单位膜，光滑平整。外膜上镶嵌的蛋白质包括多种转运蛋白，它们形成较大的水相通道跨越脂质双层，使外膜出现直径2~3nm的小孔，允许通过分子量在10000以下的物质，包括一些小分子多肽。

2.内膜

  1. 内膜(inner membrane)比外膜稍薄，也是一层单位膜。
  2. 内膜将线粒体的内部空间分成两部分，其中由内膜直接包围的空间称内腔，含有基质，也称基质腔(matrix space)；内膜与外膜之间的空间称为外腔，或膜间腔(intermembrane space)。内膜上有大量向内腔突起的折叠(infolding)，形成嵴(cristae)。嵴与嵴之间的内腔部分称嵴间腔(intercristae space),而由于嵴向内腔突进造成的外腔向内伸入的部分称为嵴内空间(intracristae space)。
  3. 内膜的化学组成中20%是脂类，80%是蛋白质，蛋白质的含量明显高于其他膜成分。
  4. 内膜通透性很小，分子量大于150的物质便不能通过。但内膜有高度的选择通透性，膜上的转运蛋白控制内外腔的物质交换，以保证活性物质的代谢。
  5. 内膜（包括嵴）的内表面附着许多突出于内腔的颗粒，每个线粒体大约有104~10个，称为基粒(elementary particle)。基粒分为头部、柄、基片三部分，由多种蛋白质亚基组成。圆球形的头部突入内腔中，基片嵌于内膜中，柄部将头部与基片相连。基粒头部具有酶活性，能催化ADP磷酸化生成ATP，因此，基粒又称ATP合酶(ATP synthase)或ATP合酶复合体（ATP synthase complex) 。

3.内外膜相互接近所形成的转位接触点是物质转运到线粒体的临时性结构

线粒体的内、外膜上存在着一些内膜与外膜相互接触的地方，在这些地方，膜间隙变狭窄，称为转位接触点(translocation contact site)，其间分布有蛋白质等物质进出线粒体的通道蛋白和特异性受体，分别称为内膜转位子(translocon of the inner membrane,Tim)和外膜转位子(translocon of the outer membrane,Tom)。

4.基质

  1. 线粒体内腔充满了电子密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分，称之为基质(matriⅸ)，是氧化代谢的场所。
  2. 线粒体中催化三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解、蛋白质合成等有关的酶都在基质中，参与物质的代谢。
  3. 此外还含有线粒体独特的双链环状DNA、核糖体，这些构成了线粒体相对独立的遗传信息复制、转录和翻译系统。因此，线粒体是人体细胞除细胞核以外唯一含有DNA的细胞器，每个线粒体中可有一个或多个DNA拷贝，形成线粒体自身的基因组及其遗传体系。

二、线粒体的化学组成

  1. 线粒体干重的主要成分是蛋白质，约占65%~70%，多数分布于内膜和基质。线粒体蛋白质分为两类：一类是可溶性蛋白，包括基质中的酶和膜外周蛋白；另一类是不溶性蛋白，为膜结构蛋白或膜镶嵌酶蛋白。
  2. 脂类占线粒体干重的25%~30%，大部分是磷脂。
  3. 此外，线粒体还含有DNA和完整的遗传系统，多种辅酶（如CoQ、FMN、FAD和NAD等）、维生素和各类无机离子。
  4. 线粒体含有众多酶系，目前已确认有120余种，是细胞中含酶最多的细胞器。这些酶分别位于线粒体的不同部位，在线粒体行使细胞氧化功能时起重要作用。有些酶可作为线粒体不同部位的标志酶，如内、外膜的标志酶分别是细胞色素氧化酶和单胺氧化酶等；基质和膜间腔的标志酶分别为苹果酸脱氢酶和腺苷酸激酶等。

三、线粒体的遗传体系

线粒体虽然有自己的遗传系统和蛋白质翻译系统，且部分遗传密码也与核密码有不同的编码含义，但它与细胞核的遗传系统构成了一个整体。

（一）线粒体DNA构成了线粒体基因组

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1.mtDNA简介

  1. 线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)通常是裸露的，为一条双链环状的DNA分子，不与组蛋白结合，存在于线粒体的基质内或依附于线粒体内膜。
  2. 双链中一为重链(H),一为轻链(L)。重链和轻链上的编码物各不相同（图6-3）。轻链仅编码了ND6及8个tRNA。轻链转录物经剪切形成8个tRNA和1个mRNA，其余几乎不含有用信息的部分被很快降解。
  3. 在一个线粒体内往往有1至数个mtDNA分子，平均为5~10个。线粒体基因组与核基因组相比，紧凑了许多。
  4. 核基因组中的非编码序列高达90%，而在线粒体基因组中只有很少非编码的序列，转录所得的mRNA无内含子且UTR很少。

2.mtDNA与nDNA的配合

  1. 线粒体中大多数酶或蛋白质仍由细胞核DNA编码，它们在细胞质中合成后经特定的方式转送到线粒体中。构成线粒体核糖体的蛋白质是由细胞质运入线粒体内的。
  2. mtDNA编码的蛋白质都是电子传递链酶复合体中的亚基，在线粒体的核糖体上进行翻译。
  3. 线粒体编码的RNA和蛋白质并不运出线粒体外。
  4. 用于蛋白质合成的所有tRNA都是由mtDNA编码的。

3.mtDNA的基因表达产物

线粒体基因组的序列共含16568个碱基对(bp)。人类线粒体基因组共编码了37个基因，主要编码线粒体的tRNA、rRNA及电子传递链酶复合体中的亚基。值得一提的是线粒体基因中两个重叠基因，一个是复合物I的ND4L和ND4，另一个是复合物V的ATP酶8和ATP酶6（图6-5）。在这37个基因中，仅13个是编码蛋白质的基因，13个序列都以ATG(甲硫氨酸)为起始密码，并有终止密码结构，长度均超过可编码50个氨基酸多肽所必须的长度。
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  1. 复合体Ⅰ：7个为NADH-CoQ还原酶复合体的亚基(ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6);
  2. 复合体Ⅲ：1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体中细胞色素b的亚基；
  3. 复合体Ⅳ：3个为构成细胞色素c氧化酶(COX)复合体催化活性中心的亚单位(COXⅠ、COXⅡ和COXⅢ)，这三个亚基与细菌细胞色素c氧化酶是相似的，其序列在进化过程中是高度保守的；
  4. 复合体V：2个为ATP合酶复合体F0部分的2个亚基(A6和A8)；
  5. 其他24个基因：编码两种rRNA分子（用于构成线粒体的核糖体）和22种tRNA分子（用于线粒体RNA的翻译）。

（二）mtDNA的转录和翻译

1.两个启动子

线粒体基因组的转录是从两个主要的启动子处开始的，分别为重链启动子(heavy-strand promoter,HSP)和轻链启动子（light-strand promoter,LSP)。

线粒体转录因子1(mitochondrialtranscription factor 1,mtTFA)参与了线粒体基因的转录调节。mtTFA可与HSP和LSP上游的DNA特定序列相结合，并在mtRNA聚合酶的作用下启动转录过程。

2.重链两个转录起始位点

重链上的转录起始位点有两个，形成两个初级转录物。

  1. 初级转录物Ⅰ：开始于tRNAPhe，终止于16SrRNA基因的末端，最终被剪切为tRNAPhe、tRNAVal、12S rRNA和16S rRNA。
  2. 初级转录物Ⅱ：起始位点比初级转录I的起始位点要稍微靠下一点，大约在12S RNA基因的5'端，它的转录通过初级转录物Ⅰ的终止位置持续转录至几乎整个重链，主要编码tRNA和mRNA。
    转录物Ⅰ的转录比转录物Ⅱ的转录要频繁得多，前者约是后者的10倍，这样rRNA和2个tRNA将比其他RNA和tRNA要合成得多。

3.与核基因组表达的不同（转录、翻译）

  1. 线粒体基因的转录类似原核生物的转录，即产生一个多顺反子(polycistronic transcription)，其中包括多个mRNA和散布于其中的tRNA，剪切位置往往发生在tRNA处，从而使不同的mRNA和tRNA被分离和释放。通常情况下，剪切在新生的转录链上就开始了。剪切的mRNA与tRNA位置是非常精确的，因为每个RNA的5'端与tRNA的3'端是紧密相连的。与核合成mRNA不同，线粒体mRNA不含内含子，也很少有非翻译区。
  2. 每个mRNA5'端起始密码的三个碱基为AUG(或AUA)，UAA的终止密码位于mRNA的3'端。某些情况下，一个碱基U就是mtDNA体系中的终止密码子，而后面的两个A是多聚腺嘌呤尾巴的一部分，这两个A往往是在mRNA前体合成好之后才加上去的。加工后的mRNA的3'端往往有约55个核苷酸多聚A的尾部，但是没有细胞核mRNA加工时的帽结构。
  3. 线粒体mRNA翻译的起始氨基酸为甲酰甲硫氨酸，这点与原核生物类似。另外线粒体的遗传密码也与核基因不完全相同（表6-1），例如UGA在核编码系统中为终止密码，但在人类细胞的线粒体编码系统中，它编码色氨酸。
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（三）mtDNA的复制

线粒体DNA的两条链有各自的复制起始点。mtDNA的复制类似于原核细胞的DNA复制，但也有自己的特点。

典型的细菌(如E.coli)环形基因组有一个复制起始点(origin),并从某一位点进行双向复制，因此子链DNA的合成既需要DNA聚合酶（以母链为模板在RNA引物上合成子链DNA),也需要RNA聚合酶（催化合成短的RNA引物)，并以相反的方向同时进行。

人类mtDNA也是单一的复制起始，mtDNA的复制起始点被分成两半，一个是在重链上，称为重链复制起始点(origin of heavy-strand replication,OH),位于环的顶部；另一个是在轻链上，称为轻链复制起始点(origin of light-strand eplication,OL)，位于环的“8”点钟位置。
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这种两个复制点的分开导致mtDNA的复制机制比较特别，需要一系列进入线粒体的核编码蛋白的协助（图6-6）。

  1. 与细菌DNA一样，mtDNA的复制也需要RNA引物作为DNA合成的起始，线粒体的RNA聚合酶从位于OH和 tRNAPhe基因之间的3个上游保守序列区段(conserved sequence blocks,CSBI、Ⅱ、Ⅲ)之一附近开始合成一段分子量相对较大的RNA引物，后者与相应的轻链互补结合，并暂时替代控制区的重链，所形成的环状结构称D环(displacement loop);（ #？ 看一下起始点的定义）
  2. 轻链的复制要晚于重链，等重链合成一定的长度后，轻链才开始合成。
  3. 一般情况下，重链的合成方向是顺时针的；轻链的合成方向是逆时针的。
  4. 两个合成方向相反的链不断地复制直到各自半环的终了，单股的母环形成一个连锁的对环( #？ OH和RNA引物之前还连着一点卷着的？)，后者在mtDNA拓朴异构酶的作用下去连锁，释放出新合成的子链（ #？ 此时两条链应该都没复制完才对，因为那部分卷着，特别是轻链应该没越过OH，我懂了，这个V就代表着那个小缺口！拓扑异构酶 - 定义、结构、类型、功能、机制 (microbiologynote.com)）
  5. 整个复制过程约持续2个小时，比一般的复制时间要长（线粒体：16568bp/2h;大肠杆菌400万bp/40min)。
  6. mtDNA复制与核 DNA复制并不同步，并不严格限制在细胞周期的S期内，复制活动贯穿于整个细胞周期。
  7. 就单独的 mtDNA分子而言，在同一个复制周期时段内可能有的tDNA复制了两次而另一些根本不进行复制。

四、线粒体核编码蛋白质的转运

线粒体中有大约有1000个基因产物，其中仅37个基因产物由线粒体基因组编码，因此线粒体内大多数蛋白都是核基因组编码的。这些线粒体蛋白在胞质中合成，之后被运进线粒体。
核编码蛋白进入线粒体的过程中需要分子伴侣蛋白的协助。绝大多数线粒体蛋白被输入到基质中，其余部分蛋白输入到膜间腔以及插入到内膜和外膜上。

（一）核编码蛋白向线粒体基质中的转运

1.核编码蛋白进入线粒体时需要信号序列

输入到线粒体的蛋白都在其N-端具有一段信号序列，研究最多的是基质导入序列(matrix-targeting sequence,MTS)，这是一段由20~50个氨基酸残基组成的疏水序列，带正电荷，富含精氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸，少见天冬氨酸和谷氨酸。

2.前体蛋白在线粒体外保持非折叠状态

当线粒体蛋白可溶性前体在核糖体内形成以后

  1. 少数前体蛋白与一种称为新生多肽相关复合物(nascent-associated complex,NAC)的分子伴侣蛋白相互作用，NAC增加了蛋白转运的准确性；
  2. 绝大多数的前体蛋白都要和一种称为热激蛋白70(heat shock protein70,hsp70)的分子伴侣结合，从而防止前体蛋白形成不可解开的构象，也可以防止已松弛的前体蛋白聚集(aggregation)。HSP70一般认为是诱导性表达，一般情况下基因没有内含子。
  3. 此外，在哺乳动物的胞质中还存在着两种能够准确结合线粒体前体蛋白的因子：
    1. 前体蛋白的结合因子（presequence-binding factor, PBF)：能够增加hsc70对线粒体蛋白的转运。HSC70，heat shock cognate protein 70, 热激同源蛋白70，一般认为是组成型表达，基因中多数情况下有1个或多个内含子。
    2. 线粒体输入刺激因子(mitochondrial import stimulatory factor,MSF)：不依赖于hsc70,常单独发挥着ATP酶的作用，为聚集蛋白的解聚提供能量。

3.分子运动产生的动力协助多肽链穿过线粒体膜

前体蛋白一旦和受体结合后，就要和外膜及内膜上膜的通道发生作用才可进入线粒体。穿膜转运需要用到线粒体基质中的分子伴侣mthsp70。
布朗棘轮模型(Brownian Rachet model)(图6-8)机制将mthsp70描绘成类似于肌球蛋白和肌动蛋白相互牵拉作用的“转运发动机”，认为：

  1. 在蛋白质转运孔道内，多肽链做布朗运动摇摆不定
  2. 一旦前导肽链自发进入线粒体腔，立即有一分子thsp70结合上去，防止前导肽链退回细胞质；
  3. 同时mthsp70通过变构产生拖力，促使前导肽链进入，并迫使后面的肽链解链以进入转运轨道。
  4. 随着肽链进一步伸入线粒体腔，肽链会结合更多的thsp70分子。
  5. 转运所需能量依靠水解ATP提供。
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4.多肽链需要在线粒体基质内重新折叠才形成有活性的蛋白质

  1. 蛋白质穿膜转运至线粒体基质后，必须恢复其天然构象以行使功能。
  2. 当蛋白穿过线粒体膜后，大多数蛋白的基质导入序列被基质作用蛋白酶(matrix processing protease,MPP)所移除。此类MPP定位于线粒体内膜上。
  3. 在大多数情况下，输入多肽的最后折叠还需要另外一套基质分子伴侣如hsc60、hsc10的协助。经过上述过程，线粒体蛋白质顺利进入线粒体基质，并成熟形成其天然构象。

（二）核编码蛋白向线粒体其他部位的转运

核编码的线粒体蛋白除了向线粒体的基质转运外，还包括向线粒体的膜间腔、内膜和外膜的转运。通常这些蛋白除了具有MTS外，还具有第2类信号序列，它们通过与进入线粒体基质类似的机制进入线粒体，而后通过二次定位到达最终目的地。

五、线粒体的起源

1.内共生学说

线粒体可能起源于与古老厌氧真核细胞共生的早期细菌，在之后的长期进化过程中，二者共生联系更加密切，共生物的大部分遗传信息转移到细胞核上，这样留在线粒体上的遗传信息大大减少。许多证据支持这一假说：

  1. 线粒体的遗传系统与细菌相似；
  2. 线粒体的蛋白质合成方式与细菌相似，如核糖体为70S,抑制蛋白质合成的机制等

2.非共生假说

认为原始的真核细胞是一种进化程度较高的需氧细菌，参与能量代谢的电子传递系统、氧化磷酸化系统位于细胞膜上。随着不断进化，细胞需要增加其呼吸功能，因此不断地增加其细胞膜的表面积，增加的膜不断地内陷、折叠、融合，并被其他膜结构包裹（形成的双层膜将部分基因组包围在其中)，形成功能上特殊（有呼吸功能）的双层膜性囊泡，最后演变为线粒体。

六、线粒体的分裂与融合

线粒体是动态的细胞器。如果在显微镜下观察活细胞中的线粒体，可见它们在持续不断地进行分裂与融合。线粒体可以相互融合连接形成网络状结构，也可以分裂形成彼此分散存在的个体，这种动态变化被称为线粒体动力学(mitochondrial dynamics)。
线粒体的融合与分裂需要外膜与内膜的共同参与，并且需要一系列蛋白分子进行精确介导和调控（表6-2）。

（一）线粒体分裂

目前普遍认为线粒体是以分裂的方式进行增殖的。线粒体的生物发生过程分两个阶段。
在第一阶段，线粒体进行分裂增殖；第二阶段包括线粒体本身的分化过程，建成能够行使氧化磷酸化功能的结构。
线粒体的分裂增殖和分化阶段分别接受细胞核和线粒体两个独立的遗传系统控制。但是，关于线粒体如何进行分裂增殖的，目前尚未完全明了。一般认为它可能包括以下三种分裂方式：

  1. 出芽分裂。线粒体分裂时先从线粒体上长出膜性突起，称为“小芽”(budding),随后小芽不断长大，并与原线粒体分离，再经过不断“发育”，最后形成新的线粒体；
  2. 收缩分裂。这种分裂方式是线粒体在其中央处收缩形成很细的“颈”，最后断裂，形成两个线粒体；
  3. 间壁分裂。这种分裂方式是线粒体的内膜向中心内褶形成分隔线粒体结构的间壁，随后再一分为二，形成两个线粒体。
    无论是哪一种分裂机制，线粒体的分裂都不是绝对均等的。例如经过复制的mtDNA在分裂后的线粒体中的分布就是不均等的。另一方面线粒体分裂还受到细胞分裂的影响。

介导线粒体分裂过程的主要蛋白有Dnml/DRP1、Fisl/FIS1、MFF等。在哺乳动物的线粒体分裂时，胞质中的DRP1会与线粒体外膜上的FIS1或其他受体蛋白结合，形成多聚体环状结构，逐渐缩窄，将线粒体一分为二（图6-10）。
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（二）复制分离

  1. 同一线粒体中，可能存在有不同类型的mtDNA，即野生型和突变型mtDNA。分裂时，野生型和突变型mtDNA发生分离，随机地分配到新的线粒体中；
  2. 同一细胞中，也可能存在着带有不同mtDNA的线粒体，如野生型和突变型线粒体。
    分裂时，野生型和突变型mtDNA(或线粒体)发生分离，随机地分配到新的线粒体（或细胞）中；使子线粒体（或子细胞）拥有不同比例的突变型mtDNA分子，这种随机分配导致mtDNA异质性变化的过程称为复制分离。
  3. 在连续的分裂过程中，异质性细胞中突变型mtDNA和野生型mtDNA的比例会发生漂变，向同质性的方向发展。
  4. 分裂旺盛的细胞往往有排斥突变mtDNA的趋势，经无数次分裂后，细胞逐渐成为只有野生型mtDNA的同质性细胞。
  5. 突变mtDNA具有复制优势，在分裂不旺盛的细胞（如肌细胞）中逐渐积累，形成只有突变型mtDNA的同质性细胞。漂变的结果是细胞表型也随之发生改变。

（三）线粒体融合

伴随着细胞的衰老，mtDNA会累积很多的突变，线粒体的融合可以使不同线粒体的基因组交换进行充分的DNA互补，并有效地修复这些DNA突变，保证线粒体正常的功能。
线粒体膜电位也会影响线粒体的融合与分裂。实验显示如果分裂后新形成的子代线粒体具有较高的膜电位，线粒体将能够进行下一次的融合、分裂循环；如果子代线粒体的膜电位下降，出现去极化，线粒体将发生自噬而被清除。

七、线粒体的功能

  1. 主要功能：营养物质在线粒体内氧化并与磷酸化耦联生成ATP。
  2. 调节胞质中的Ca2+浓度：线粒体在摄取Ca2+和释放Ca2+中起着重要的作用，和内质网一起共同调节胞质中的Ca2+浓度。
  3. 细胞死亡：也与线粒体有关。在某些情况下，线粒体是细胞死亡的启动环节；而在另一些情况下，线粒体则仅仅是细胞死亡的一条“通路”（详见第十六章）。线粒体在能量代谢和自由基代谢过程中产生大量超氧阴离子，并通过链式反应形成活性氧(rective oxygen species,ROS)，当ROS水平较低时，可促进细胞增生；而ROS水平较高时，使得线粒体内膜非特异性通透性f孔道(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放，不仅导致跨膜电位崩溃，也使细胞色素c外漏，再启动caspase的级联活化，最终由caspase-3启动凋亡。